Molekularny czynnik wywołujący międzykontynentalne epidemie Streptococcus grupy A.

W zasadzie możliwe jest, że zmiany sekwencji nukleotydów w regionie regulacyjnym powyżej nga są odpowiedzialne za zwiększoną transkrypcję obserwowaną w szczepach epidemii. Alternatywnie inaktywacja inaktywacji hipotetycznego regulatora ujemnego lub nabycie nieznanego czynnego regulatora działającego trans może spowodować przesunięcie w czasie fenotypu wytwarzania SPN (13). Odnotowano także rearanżację genomu, która wpływa na ekspresję genu slo (18). Aby rozróżnić te możliwości, przebadaliśmy 3,615 genomów M1 serotypu pod kątem polimorfizmów, które mogą spowodować dezaktywację ujemnego regulatora genu. Przeszukaliśmy również genomy, aby uzyskać dowody nabycia genu pozytywnego regulatora o działaniu trans lub nowatorskich rearanżacji genomowych, które mogą zmienić ekspresję genów. Nie znaleźliśmy żadnych dowodów na tego rodzaju zmiany genetyczne, które uwzględniałyby przejście na zwiększoną ekspresję nga, ifs i slo. Następnie przeanalizowaliśmy sekwencje genomowe 3615 pod kątem polimorfizmów w górnym regionie promotorowym genu nga, który w zasadzie mógłby zmienić transkrypcję. Bez względu na pochodzenie geograficzne wszystkie szczepy epidemiczne miały ten sam allel (SNP G-22T i T-18C) znajdujący się w promotorze (rysunek 1). Ponieważ zmienność sekwencji regionów promotorowych przerywników może zmieniać poziomy transkryptu w bakteriach (19, 20), postawiliśmy hipotezę, że te dwa SNP spowodowały różnicę w poziomach nga, ifs i slo transkryptu między szczepami przed epidemią i epidemią. Aby przetestować tę hipotezę, skonstruowaliśmy serię zmutowanych izoallelicznych szczepów z szczepu referencyjnego MGAS2221 typu dzikiego (Supplemental Figure 1, materiał uzupełniający dostępny online w tym artykule; doi: 10.1172 / JCI82478DS1). Zastosowano szczep rodzicielski MGAS2221, ponieważ nie ma on polimorfizmów modyfikujących funkcjonalność w znanych genach regulatorowych, jego genom został zsekwencjonowany z bardzo wysoką dokładnością i był stosowany w badaniach wirulencji zwierząt (3). Ponadto szczep znajduje się u podstawy gałęzi filogenetycznej, dając początek wszystkim nowym epidemicznym szczepom M1 (rysunek 2A). Spodziewaliśmy się, że wprowadzenie jednego lub obu SNP w regionie rozdzielającym do szczepu MGAS2221 znacząco zmniejszy poziom transkryptów nga i slo wytworzonych przez zmutowany szczep do poziomu wytworzonego przez szczepy przed epidemią i spowoduje zmniejszenie wirulencji szczepu. Zmienność alleliczna w regionie przerywnika promotora zmienia poziomy transkrypcji genu toksyny i produkcję toksyny. Generowanie SNP G-22T i T-18C razem w rodzicielskim szczepie MGAS2221 znacząco zmniejszyło poziom transkryptu nga i slo (Figura 3, A i B oraz Suplementowa Figura 1). Poziomy transkryptów nga i slo wytworzone przez zmutowany szczep izo parallelic nga (G-22T / T-18C) i szczep SF370 (który naturalnie zawiera te dwa polimorfizmy) nie różniły się znacząco (Figura 3B). Figura 3 Charakterystyka in vitro referencji GAS M1 i zmutowanych szczepów izoelementowych. (A) Schemat przedstawiający docelowy genotyp SNP badanych szczepów. (B) TaqMan Analiza qRT-PCR poziomów transkryptów nga i slo w odniesieniu do poziomów MGAS2221. (C) Analiza Western immunoblot wydzielanych SPN i SLO w supernatantach hodowli. (D) aktywność cytolityczna SLO względem aktywności MGAS2221 i NADazy SPN. Testy transkryptu, cytolizy i NADazy przeprowadzono trzykrotnie w 3 oddzielnych okazjach. Replikacja danych jest wyrażona jako średnia. SD w B i D. * P <0,05 w porównaniu z MGAS2221; #P <0,05 vs. nga (G-22T); P <0,05 vs. nga (T-18C), 2-ogonkowy test ucznia; n = 3. Następnie badaliśmy zdolność każdego z tych dwóch SNP w izolacji w celu znacznego zmniejszenia transkrypcji nga i slo poprzez tworzenie zmutowanych szczepów izoallelicznych ze szczepu MGAS2221, które zawierają oddzielnie G-22T lub T-18C (Figura 3A i Suplementowa Figura ) [hasła pokrewne: gim 94, badanie kariotypu, blok serca ]

Molekularny czynnik wywołujący międzykontynentalne epidemie Streptococcus grupy A.

Szczep MGAS2221 nie ma polimorfizmów w genach regulatorowych, o których wiadomo, że mają wpływ na wirulencję, takich jak covRS, ropB i mga. Wcześniejsza analiza mikromacierzy z transkryptomów pre-epidemicznych i epidemicznych szczepów M1 wykazała, że tylko 8 rdzeniowych genów chromosomowych zostało transkrybowanych różnicowo między dwiema grupami szczepów we wczesnej fazie wzrostu logarytmicznego (12). Biorąc pod uwagę wyraźne dowody na to, że pre-epidemiczne i epidemiczne szczepy M1 różnią się znacznie pod względem zjadliwości, przetestowaliśmy hipotezę, że analiza mikromacierzy ekspresji nie pozwoliła zidentyfikować genów wirulencji krytycznie różnicowanych między dwiema grupami szczepów. Przeanalizowaliśmy globalne różnice transkryptomowe w panelu pre-epidemicznych i epidemicznych szczepów M1 przy użyciu analizy sekwencji RNA (RNA-Seq), bardziej czułej i dokładnej metody analizy transkryptów. Analiza RNA-Seq wykryła 5 genów o różnej ekspresji, potwierdzając nasze wcześniejsze wyniki mikromacierzy z bardzo ograniczonymi różnicami w genach między szczepami przed epidemią i epidemią. (więcej…)

Molekularny czynnik wywołujący międzykontynentalne epidemie Streptococcus grupy A.

Jednak procesy patogenezy molekularnej leżące u podstaw tego, jak to ostateczne wydarzenie genetyczne spowodowało globalne rozprzestrzenienie się potomstwa pojedynczej komórki bakteryjnej i wywołały uderzający wzrost częstotliwości infekcji i nasilenia, pozostają nieznane. Szczególnie interesujące, przy próbie zrozumienia pojawienia się i epidemii szczepu paciorkowców, jest zastąpiony obszar genomowy kodujący nga i slo geny odpowiednio dla SPN i SLO. Wiele ról w inwazyjnych infekcjach zostało przypisanych do SPN. SPN zwiększa przeżycie GAS poprzez hamowanie internalizacji patogenów przez komórki gospodarza, a także zwiększa cytotoksyczność SLO (7. 10). (więcej…)

Molekularny czynnik wywołujący międzykontynentalne epidemie Streptococcus grupy A.

Identyfikacja zdarzeń molekularnych odpowiedzialnych za pojawianie się szczepów, zwiększoną wirulencję i epidemię była celem od dawna dążącym do badań nad chorobami zakaźnymi. Niedawna analiza 3615 genomów szczepów Streptococcus serotypu M1 grupy A (tzw. Bakteria zjadająca mięso) zidentyfikowała zdarzenie rekombinacji, które pokrywa się z globalną pandemią M1, rozpoczynającą się na początku lat osiemdziesiątych. Tutaj pokazaliśmy, że zmienność alleliczna, która wynika z tego zdarzenia rekombinacji, która zastępuje region chromosomowy kodujący wydzielaną NADazę i streptolizynę O, jest kluczowym czynnikiem zwiększonej produkcji toksyny i zwiększonej ciężkości infekcji szczepów pandemicznych M1. Używając zmutowanych szczepów izoelementowych odkryliśmy, że 3 polimorfizmy w tym regionie genu toksyny zwiększają odporność na zabijanie przez ludzkie leukocyty polimorfojądrowe, zwiększają proliferację bakterii i zwiększają zjadliwość w zwierzęcych modelach zapalenia gardła i martwiczego zapalenia powięzi. (więcej…)

Molekularny czynnik wywołujący międzykontynentalne epidemie Streptococcus grupy A.

Zmutowane mutelezowe szczepy z każdym z 3 wariantów regionu dystansującego promotora potwierdziły, że SNP w regionie regulatorowym nga-slo upstream są odpowiedzialne za zwiększone transkrypty genów, wytwarzanie toksyny i wirulencję myszy (Figura 7, C i D). Późniejsza analiza sekwencji genomowej 1125 M89 wykazała obecność 3 głównych kladów szczepów M89, oznaczonych jako klade-1, klade-2 i klade-3. Szczepy w każdym z 3 kladów mają unikalną sekwencję regionu promotorowego nga (dodatkowa Figura 7). Wszystkie szczepy klade-1 mają region promotora wariantu 1, wszystkie szczepy klade-2 mają region promotora wariantu 2, a wszystkie szczepy klade-3 mają wariant regionu promotorowego 3 (suplementowa figura 7). Ryc. (więcej…)

Molekularny czynnik wywołujący międzykontynentalne epidemie Streptococcus grupy A.

Stwierdziliśmy, że szczep MGAS2221 był znacznie bardziej zjadliwy niż potrójnie-SNP, zmutowany szczep mutanta nga (G-22T / T-18C / G989A), co oceniono na podstawie obciążenia bakteryjnego odzyskanego w trakcie eksperymentu (Figura 6A). Ponadto, zwierzęta zakażone zmutowanym szczepem izoalilowym miały znacząco niższy poziom nieżywotnych PMNs w tylnej części ustnej gardła (Figura 6B). TaqMan qRT-PCR potwierdziła, że poziom nga i slo transkryptu obecnych in situ w próbkach wymazu z gardła był znacząco niższy u zwierząt zaszczepionych szczepem zmutowanym izoalilaktycznie (Figura 6C). Rycina 6 Szczep macierzysty wirusa MGAS2221 jest znacznie bardziej zjadliwy niż potrójnie zmutowany szczep mitochondrialny SNP w modelu infekcji górnych dróg oddechowych nieludzkiego naczelnego. (A) Makaki Cynomolgus (n = 4 na szczep) zostały zaszczepione w górnych drogach oddechowych epidemicznym rodzicielskim szczepem dzikiego typu MGAS2221 lub szczepem mutagennym potrójnie-SNP nga (G-22T / T-18C / G989A). (więcej…)

Molekularny czynnik wywołujący międzykontynentalne epidemie Streptococcus grupy A.

Wartości P obliczono za pomocą testu Manna-Whitneya. (E) Oceny histopatologiczne kończyn myszy zainfekowanych każdym szczepem (n = 3 na szczep). Dane są wyświetlane jako średnie. SEM. Wartości P obliczono za pomocą testu Manna-Whitneya. (więcej…)

Molekularny czynnik wywołujący międzykontynentalne epidemie Streptococcus grupy A.

Wartości P określono za pomocą testu log-rank. (B) CFU GAS na gram zainfekowanej kończyny tylnej w 96 godzin po zakażeniu (n = 20 na szczep) i względne poziomy transkryptów (n = 3 na szczep) nga i slo ekstrahowano z porażonych kończyn tylnych w 96 godzin po zakażeniu. Dane CFU są wyrażone jako średnia. SEM. Dane transkrypcji są wyrażone jako średnia. (więcej…)

Molekularny czynnik wywołujący międzykontynentalne epidemie Streptococcus grupy A.

W porównaniu ze szczepem rodzicielskim MGAS2221, poziomy transkrypcji nga i slo in strain nga (G-22T) były znacząco zmniejszone (Figura 3B). Ponadto poziomy transkrypcji nga i slo w zmutowanym szczepie nga (T-18C) zostały zmniejszone do znacznie większej wielkości (Figura 3B). Wprowadzenie SNP G989A do regionu kodującego nga nie wpłynęło na poziomy transkrypcji nga i slo (Figura 3B). Podsumowując, wyniki te wskazują, że (a) dwa SNP (G-22T i T-18C) w regionie dystansowym promotora nga znacząco wpływają na poziomy transkrypcji nga i slo, (b) brak znaczącej różnicy w transkrypcie nga i slo poziomy pomiędzy zmutowanym szczepem nga (G-22T / T-18C) i szczepem SF370 pokazują, że te dwie zmiany nukleotydowe przyczyniają się do zwiększonego poziomu transkrypcji nga i slo w szczepach epidemicznych, oraz (c) SNPs G-22T i T-18C każdy przyczynia się do zmienionej ekspresji nga i slo, przy SNP T-18C wywierając większy efekt niż G-22T na obfitość transkryptu. Analiza Western immunoblot SPN i SLO w supernatancie hodowli potwierdziła, że SNP G-22T i T-18C w regionie przerywnikowym a35 i A10 zasadniczo zmieniły ilość produkcji tych dwóch toksyn (Figura 3C). (więcej…)

Molekularny czynnik wywołujący międzykontynentalne epidemie Streptococcus grupy A.

Powstały szczep nga (G-22T / T-18C) był zsekwencjonowanym genomem jako ostatecznym potwierdzeniem allelicznego zastąpienia i sprawdzenia spontanicznego generowania niepożądanych niepożądanych polimorfizmów potencjalnie wpływających na ekspresję / aktywność nga / slo. Konstruowanie zmutowanych szczepów nato (G-22T) i nga (T-18C) pojedynczo-SNP. Analogicznie do procedury opisanej w celu wprowadzenia SNP G-22T i T-18C do promotora nga zastosowano metodę PCR z wewnętrznym wyjściem, aby wprowadzić te SNP indywidualnie do pBBL740-ngapro. Fosforylowane startery ngapro5 i ngaproGT zastosowano do wprowadzenia SNP G-22T do promotora nga. Podobnie, zastosowano fosforylowane startery ngapro5 i ngaproTC (patrz Tabela uzupełniająca dla sekwencji starterów) w celu wprowadzenia SNP T-18C do promotora nga. (więcej…)

Molekularny czynnik wywołujący międzykontynentalne epidemie Streptococcus grupy A.

Szczepy MGAS2221 i MGAS26844 zostały wybrane jako rodzicielskie częściowo dlatego, że nie mają mutacji zmieniających funkcje w głównych genach regulacyjnych (mga, covRS, ropB, itp.), O których wiadomo, że zmieniają globalny transkryptom i wirulencji. Ponadto, jak wykazano przez sekwencjonowanie genomu 3615 szczepów, MGAS2221 jest genetycznie reprezentatywny dla epidemicznego klonu serotypu Ml i dostępna jest dla niego sekwencja genomu o bardzo wysokiej jakości. Badane szczepy kliniczne zebrano w ramach kompleksowych badań populacyjnych nad inwazyjnymi zakażeniami. Szczepy emm1 zostały opisane wcześniej (3). Szczepy emm89 otrzymano z kolekcji kultur przechowywanych w CDC, w Finlandii i Islandii. (więcej…)

Molekularny czynnik wywołujący międzykontynentalne epidemie Streptococcus grupy A.

Nasze dane sugerują, że zwiększona produkcja SPN i SLO tworzy patogen o zwiększonej sprawności w górnych drogach oddechowych, co skutkuje zdolnością do rozsiewania w bardzo krótkim czasie i powoduje obfite infekcje u ludzi podatnych na zakażenie (Ryc. 8). Po drugie, wykazaliśmy, że zwiększona produkcja SPN i SLO prowadzi do bardziej rozległego niszczenia tkanek, co odzwierciedla wyniki kliniczne u zakażonych pacjentów (24). Po trzecie, obserwacja zwiększonej odporności na zabijanie przez ludzkie PMN, kluczowe mediatory wrodzonej ochrony immunologicznej, jest zgodna z innymi doniesieniami dotyczącymi roli tych dwóch silnie wydzielanych toksyn w patogenezie. Tak więc, zwiększona produkcja SPN i SLO jest eleganckim mechanizmem do tworzenia patogenów, które są szczególnie biegli w dynamicznym przenoszeniu fal epidemii w całej ludzkiej populacji i powodują niezwykle agresywne infekcje. (więcej…)

Molekularny czynnik wywołujący międzykontynentalne epidemie Streptococcus grupy A.

Ponadto, nowe wirusy są czasami generowane przez rekombinacyjny reasortment, proces dobrze opisany dla wirusów grypy (34, 35). Jednakże, pomimo pewnych postępów (34, 36), identyfikacja precyzyjnych genetycznych zdarzeń molekularnych i patogennych mechanizmów, które prowadzą do pojawienia się szczepu patogenu, zmienionej wirulencji i epidemii, ogólnie była nieuchwytnym celem w badaniach nad chorobami zakaźnymi. Tego rodzaju informacji brakuje szczególnie patogennym bakteriom ludzkim. W tej pracy, wykorzystując podejście integracyjne i modelowy organizm, moc wysokowydajnego sekwencjonowania genomu około 5000 izolatów bakteryjnych, kompleksowe próbki szczepów populacyjnych, genetykę molekularną i modele zakażenia zwierząt, zajęliśmy się ważnym pytaniem w badania nad chorobami zakaźnymi. Nieoczekiwanie, w przypadku obu ludzkich epidemii ludzkich streptokoków serotypu M1 i M89, niezależne rekombinacyjne zdarzenia zastępcze obejmowały nabycie wariantu regionu dystansującego promotora charakteryzującego się tymi samymi dwoma SNP w promotorze nga, ifs i slo. (więcej…)