Desmin Myopathy, miopatia szkieletowa z kardiomiopatią spowodowaną mutacjami w genie Desmina czesc 4

Aby określić, czy mutacje te są pospolitymi zmianami DNA, przebadaliśmy od 150 do 211 zdrowych niespokrewnionych osobników z populacji amerykańskiej i europejskiej pod kątem tych mutacji. Mutacje w genie .B-krystaliny, kodujące białko opiekuńcze, badano przesiewowo przez bezpośrednie sekwencjonowanie produktów PCR każdego eksonu. Amplifikację przeprowadzono za pomocą starterów i warunków PCR, jak opisano poprzednio.15
Ekspresja Desmina w hodowanych komórkach
Wektory ekspresyjne dla normalnych i zmutowanych desminy wprowadzono do komórek SW13 (wimentynie-ujemnych). Ponieważ komórki te nie eksprymują desminy pośredniej, wimentyny lub keratyny, są idealne do oceny, czy zmutowany desmina może tworzyć sieć pośrednich włókien. Fragment DNA obejmujący desminy cDNA, w tym kodony start i stop, amplifikowano metodą PCR z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) i wklonowano do wektora ekspresyjnego pCR2.1. Całą sekwencję każdego klonu zweryfikowano przez analizę sekwencji. Wektory ekspresyjne Desmin skonstruowano dla każdej zidentyfikowanej mutacji przez klonowanie fragmentu Hind III-XhoI o długości 1,5 kb klonu pCR2.1 zawierającego normalne lub zmutowane cDNA desminy do ssaczego wektora ekspresyjnego pcDNA3.1. Komórki SW13 (ujemne pod względem wimentyny) hodowano do 50-procentowego zlewania z minimalnym podłożem minimalnym Dulbecco zawierającym 10% surowicy płodowej cielęcej i transfekowano za pomocą odczynnika do transfekcji (Effectene, Qiagen). Czterdzieści osiem godzin po transfekcji komórki przemyto, eksponowano na 4% paraformaldehydu przez 15 minut i inkubowano z ludzkim desminowanym monoklonalnym przeciwciałem (D1033, Sigma) przez 16 godzin w temperaturze 4 ° C. W przypadku przeciwciała drugorzędowego zastosowano skoniugowaną z rhodaminą antygenową IgG (T7657, Sigma). Komórki obserwowano i fotografowano pod mikroskopem konfokalnym. Transfekowane komórki ze wszystkich mutacji poddano również obróbce pod mikroskopem elektronowym.13
Wyniki
Badania świetlno-mikroskopowe, immunocytochemiczne i ultrastrukturalne
Najbardziej spójnym odkryciem w każdej próbce z biopsji mięśniowej była obecność niebieskich nagromadzeń w obszarach podskórnych lub centralnie położonych (ryc. 1A). W odcinkach seryjnych nagromadzenia te były silnie immunoreaktywne podczas barwienia przeciwciałami przeciwko desmina (Figura 1B). Liczba włókien z dodatnimi nagromadzeniami desminy różniła się pomiędzy próbkami i nie korelowała z nasileniem osłabienia mięśni. Wszystkie regiony pozytywne dla desminy były również silnie pozytywne dla dystrofiny i zmiennie dodatnie dla wimentyny lub .-spektryny, jak opisano wcześniej.1-3 Vacuole (ryc. 1), wiele z nich było otoczonych czerwonymi obwódkami, a małe skupiska prętów obserwowano w próbkach od pięciu z sześciu pacjentów. Wiele jąder, włókien atroficznych i ciałek cytoplazmatycznych było powszechnych. W mikroskopie elektronowym rozerwanie miofibrylarne, fragmenty cienkich i grubych włókien, strumienie Z i złogi gęstego, amorficznego materiału (ryc. 1C i ryc. 1D) były widoczne we wszystkich badanych próbkach. Nie obserwowano akumulacji włókien pośrednich.
Analiza sekwencji Desmin Gene
Tabela 2. Tabela 2. Mutacje w genie Desmina zidentyfikowane u pacjentów z miopatią Desmina
[podobne: niedociśnienie ortostatyczne, nerw bloczkowy, półpasiec icd 10 ]
[patrz też: heparegen opinie, włosogłówka objawy, opryszczka sromu ]